habari

Mmenyuko wa mnyororo wa Polymerase (PCR)

AP.BIO:

IST-1 (EU)

,

IST ‑ 1.P (LO)

,

IST-1.P.1 (EK)

Mbinu inayotumiwa kukuza, au kutengeneza nakala nyingi za eneo mahususi la DNA.

 

Mambo muhimu:

  • Mmenyuko wa mnyororo wa Polymerase, au PCR, ni mbinu ya kutengeneza nakala nyingi za eneo maalum la DNA vitro (kwenye bomba la mtihani badala ya kiumbe).
  • PCR inategemea DNA polymerase inayoweza kutibika, Taq polymerase, na inahitaji DNA primers iliyoundwa mahsusi kwa eneo la DNA la kupendeza.
  • Katika PCR, mmenyuko unarudiwa kwa baiskeli kupitia safu ya mabadiliko ya joto, ambayo huruhusu nakala nyingi za mkoa unaolengwa kutengenezwa.
  • PCR ina utafiti na matumizi mengi ya vitendo. Inatumiwa mara kwa mara katika uundaji wa DNA, uchunguzi wa matibabu, na uchambuzi wa uchunguzi wa DNA.

PCR ni nini?

Mmenyuko wa mnyororo wa Polymerase (PCRni mbinu ya kawaida ya maabara inayotumiwa kutengeneza nakala nyingi (mamilioni au mabilioni!) ya mkoa fulani wa DNA. Kanda hii ya DNA inaweza kuwa kitu chochote ambacho jaribio linavutiwa nalo. Kwa mfano, inaweza kuwa jeni ambayo kazi ambayo mtafiti anataka kuelewa, au alama ya maumbile inayotumiwa na wanasayansi wa uchunguzi ili kulinganisha eneo la uhalifu la DNA na watuhumiwa.

Kwa kawaida, lengo la PCR ni kufanya kutosha kwa eneo lengwa la DNA ambalo linaweza kuchambuliwa au kutumiwa kwa njia nyingine. Kwa mfano, DNA iliyokuzwa na PCR inaweza kutumwa mpangilio, imeonekana na electrophoresis ya gel, au umbo kwa plasmid kwa majaribio zaidi.

PCR hutumiwa katika maeneo mengi ya biolojia na dawa, pamoja na utafiti wa biolojia ya Masi, utambuzi wa matibabu, na hata matawi mengine ya ikolojia.

Taq polymerase

Kama Kuiga DNA katika kiumbe, PCR inahitaji enzyme ya DNA polymerase ambayo hufanya nyuzi mpya za DNA, ikitumia nyuzi zilizopo kama templeti. Polymerase ya DNA kawaida hutumiwa katika PCR inaitwa Taq polymerase, baada ya bakteria inayostahimili joto ambayo ilitengwa nayo (Tmkundu aquaticus).

T. majini anaishi katika chemchemi za moto na matundu ya maji. DNA polymerase yake ni thabiti sana na inafanya kazi karibu 70 ° \ maandishi C70 ° C70, °, maandishi ya kuanza, C, maandishi ya kumaliza (joto ambalo mwanadamu au E. coli DNA polymerase haifanyi kazi). Utulivu huu wa joto hufanya Taq polymerase bora kwa PCR. Kama tutakavyoona, joto la juu hutumiwa mara kwa mara katika PCR hadi dhehebu template ya DNA, au tenga nyuzi zake.

Vitabu vya PCR

Kama polima nyingine za DNA, Taq polymerase inaweza tu kutengeneza DNA ikiwa imepewa mwanzo, mlolongo mfupi wa nyukleotidi ambayo hutoa mahali pa kuanza kwa usanisi wa DNA. Katika athari ya PCR, jaribio huamua eneo la DNA ambalo litanakiliwa, au kukuzwa, na viti vya kwanza yeye atachagua.

Vipimo vya PCR ni vipande vifupi vya DNA iliyokatwa moja, kawaida karibu na nyukleotidi za 202020 kwa urefu. Primers mbili hutumiwa katika kila mmenyuko wa PCR, na zimeundwa ili ziwe karibu na eneo lengwa (mkoa ambao unapaswa kunakiliwa). Hiyo ni, wanapewa mfuatano ambao utawafanya wafungamane na nyuzi tofauti za templeti ya DNA, pembezoni tu mwa mkoa kunakiliwa. Vitabu hufunga kwenye templeti kwa kuoanisha msingi msingi.

Kiolezo cha DNA:

5 "TATCAGATCCATGGAGT… GAGTACTAGTCCTATGAGT 3" 3 "ATAGTCTAGGTACCTCA… CTCATGATCAGGATACTCA 5"

Kwanza 1: 5 "CAGATCCATGG 3" Primer 2:

Wakati primers zimefungwa kwenye templeti, zinaweza kupanuliwa na polymerase, na mkoa uliopo kati yao utanakiliwa.

[Mchoro wa kina zaidi unaonyesha DNA na mwelekeo wa mwanzo]

Hatua za PCR

Viungo muhimu vya athari ya PCR ni Taq polymerase, primers, template ya DNA, na nucleotides (vitalu vya ujenzi wa DNA). Viungo vimekusanywa kwenye bomba, pamoja na viboreshaji vinavyohitajika na enzyme, na huwekwa kupitia mizunguko ya kurudia ya kupokanzwa na baridi ambayo inaruhusu DNA kutengenezwa.

Hatua za kimsingi ni:

  1. Utengano (96 ° \ maandishi C96 ° C96, °, anza maandishi, C, maandishi ya kumaliza): Pasha majibu kwa nguvu ili kutenganisha, au kugeuza, nyuzi za DNA. Hii hutoa templeti iliyokwama moja kwa hatua inayofuata.
  2. Kuunganisha (555555 - 656565 ° \ maandishi C ° C °, anza maandishi, C, maandishi ya kumalizia): Baridi majibu ili viboreshaji viweze kuambatana na mlolongo wao wa nyongeza kwenye templeti ya DNA iliyokwama moja.
  3. Ugani (72 ° \ maandishi C72 ° C72, °, anza maandishi, C, maandishi ya kumaliza): Ongeza joto la athari ili Taq polymerase inaongeza viboreshaji, ikiunganisha nyuzi mpya za DNA.

Mzunguko huu unarudia mara 252525 - 353535 katika athari ya kawaida ya PCR, ambayo kwa jumla huchukua masaa 222 - 444, kulingana na urefu wa mkoa wa DNA kunakiliwa. Ikiwa athari ni nzuri (inafanya kazi vizuri), eneo lengwa linaweza kutoka kwa nakala moja au chache hadi mabilioni.

Hiyo ni kwa sababu sio tu DNA asili ambayo hutumiwa kama kiolezo kila wakati. Badala yake, DNA mpya ambayo imetengenezwa kwa duru moja inaweza kutumika kama kiolezo katika duru inayofuata ya usanisi wa DNA. Kuna nakala nyingi za kwanza na molekuli nyingi za Taq polymerase inayozunguka katika athari, kwa hivyo idadi ya molekuli za DNA zinaweza takribani maradufu katika kila raundi ya baiskeli. Mfumo huu wa ukuaji wa kielelezo umeonyeshwa kwenye picha hapa chini.

Kutumia electrophoresis ya gel kuibua matokeo ya PCR

Matokeo ya athari ya PCR kawaida huonyeshwa (kufanywa kuonekana) kwa kutumia electrophoresis ya gelGel electrophoresis ni mbinu ambayo vipande vya DNA hutolewa kupitia tumbo la gel na mkondo wa umeme, na hutenganisha vipande vya DNA kulingana na saizi. Kiwango, au ngazi ya DNA, kawaida hujumuishwa ili saizi ya vipande kwenye sampuli ya PCR iamuliwe.

Vipande vya DNA vya urefu huo huunda "bendi" kwenye gel, ambayo inaweza kuonekana kwa jicho ikiwa gel ina rangi ya rangi inayofunga DNA. Kwa mfano, athari ya PCR inayozalisha kipande cha jozi 400400400 (bp) itaonekana kama hii kwenye gel:

Njia ya kushoto: Ngazi ya DNA iliyo na bendi 100, 200, 300, 400, 500 bp.

Njia ya kulia: matokeo ya athari ya PCR, bendi kwa 400 bp.

Bendi ya DNA ina nakala nyingi, nyingi za eneo lengwa la DNA, sio nakala moja au chache. Kwa sababu DNA ni microscopic, nakala nyingi lazima ziwepo kabla ya kuiona kwa jicho. Hii ni sehemu kubwa ya kwanini PCR ni zana muhimu: hutoa nakala za kutosha za mlolongo wa DNA ambao tunaweza kuona au kudhibiti mkoa huo wa DNA.

Maombi ya PCR

Kutumia PCR, mlolongo wa DNA unaweza kukuzwa mamilioni au mabilioni ya nyakati, ikitoa nakala za DNA za kutosha kuchanganuliwa kwa kutumia mbinu zingine. Kwa mfano, DNA inaweza kuonyeshwa na gel electrophoresis, iliyotumwa kwa mpangilio, au kumeng'enywa na vimeng'enya vya kizuizi na umbo ndani ya plasmid.

PCR hutumiwa katika maabara mengi ya utafiti, na pia ina matumizi ya vitendo katika uchunguzi, uchunguzi wa maumbile, na uchunguzi. Kwa mfano, PCR hutumiwa kukuza jeni zinazohusiana na shida za maumbile kutoka kwa DNA ya wagonjwa (au kutoka kwa DNA ya fetasi, katika kesi ya upimaji wa ujauzito). PCR pia inaweza kutumika kupima bakteria au virusi vya DNA katika mwili wa mgonjwa: ikiwa pathojeni iko, inaweza kukuza maeneo ya DNA yake kutoka kwa sampuli ya damu au tishu.

Shida ya mfano: PCR katika forensics

Tuseme kwamba unafanya kazi katika maabara ya uchunguzi. Umepokea tu sampuli ya DNA kutoka kwa nywele iliyoachwa kwenye eneo la uhalifu, pamoja na sampuli za DNA kutoka kwa watuhumiwa watatu wanaowezekana. Kazi yako ni kuchunguza alama fulani ya maumbile na kuona ikiwa mtuhumiwa yeyote kati ya hao watatu analingana na DNA ya nywele kwa alama hii.

Alama huja katika alleles mbili, au matoleo. Moja ina kurudia moja (mkoa wa kahawia hapa chini), wakati nyingine ina nakala mbili za kurudia. Katika mmenyuko wa PCR na viboreshaji ambavyo viko kando ya mkoa unaorudia, mwamba wa kwanza hutengeneza maandishi ya 200200200 \ maandishi {bp} bpstart maandishi, b, p, mwisho wa maandishi ya kipande cha DNA, wakati wa pili hutengeneza maandishi ya 300300300 \ maandishi {bp} bpstart, b , p, mwisho maandishi ya kipande cha DNA:

Alama 1: alama ya kwanza ya mkoa wa kurudia huongeza kipande cha 200 bp ya DNA

Alama 2: alama ya kurudisha nyuma ya mkoa huongeza kipande cha 300 bp ya DNA

Unafanya PCR kwenye sampuli nne za DNA na kuibua matokeo na gel electrophoresis, kama inavyoonyeshwa hapa chini:

Gel ina vichochoro vitano:

Njia ya kwanza: Ngazi ya DNA iliyo na bendi 100, 200, 300, 400, na 500 bp.

Njia ya pili: DNA kutoka eneo la uhalifu, bendi ya bp 200.

Njia ya tatu: Mtuhumiwa # 1 DNA, 300 bp bendi.

Njia ya nne: Mtuhumiwa # 2 DNA, 200 na 300 bp bendi.

Njia ya tano: Mtuhumiwa # 3 DNA, 200 bp band.

DNA ya mtuhumiwa gani inalingana na DNA kutoka eneo la uhalifu kwenye alama hii?

Chagua jibu 1:

Chagua jibu 1:

(Chaguo A)

A

Mtuhumiwa 111

(Chaguo B)

B

222

(Chaguo C)

C

333

(Chaguo D)

D

Hakuna mtuhumiwa

[Kidokezo]

Hatukuweza kupanga jibu lako. Inaonekana umeacha kitu tupu au umeingiza jibu batili.

Angalia

Zaidi kuhusu PCR na forensics

Katika vipimo halisi vya uchunguzi wa DNA kutoka eneo la uhalifu, mafundi wangefanya uchambuzi sawa na ile ya mfano hapo juu. Walakini, alama kadhaa tofauti (sio tu alama moja katika mfano) zingelinganishwa kati ya eneo la uhalifu la DNA na DNA ya watuhumiwa.

Pia, alama zinazotumiwa katika uchambuzi wa kawaida wa kiuchunguzi hazitoki katika aina mbili tu tofauti. Badala yake, wao ni wa hali ya juu polymorphic (nyingi = nyingi, morph = fomu). Hiyo ni, huja katika alleles nyingi ambazo hutofautiana katika nyongeza ndogo za urefu.

Aina ya alama inayotumiwa zaidi katika uchunguzi wa sheria, inayoitwa sanjari fupi hurudia (STR), zinajumuisha nakala nyingi zinazorudia za mlolongo mfupi wa nyukleotidi (kawaida, 222 hadi 555 za nyuklia). Sehemu moja ya STR inaweza kuwa na marudio ya 202020, wakati mwingine anaweza kuwa na 181818, na mwingine tu 101010 ^ 11start superscript, 1, mwisho wa maandishi.

Kwa kuchunguza alama nyingi, ambayo kila moja inakuja katika aina nyingi za allele, wanasayansi wa uchunguzi wanaweza kujenga "alama ya kidole" ya kipekee kutoka kwa sampuli ya DNA. Katika uchambuzi wa kawaida wa STR kwa kutumia alama 131313, uwezekano wa chanya ya uwongo (watu wawili wenye "alama ya kidole" sawa ya DNA) ni chini ya 111 kwa 101010 \ maandishi {bilioni} maandishi ya kuanzia bilioni, b, i, l, l, i, o, n, maandishi ya kumalizia ^ maandishi ya juu ya 11, 1, mwisho wa maandishi!

Ingawa tunaweza kufikiria ushahidi wa DNA unatumiwa kuwatia hatiani wahalifu, umechukua jukumu muhimu katika kuwaondoa watuhumiwa wa uwongo (pamoja na wengine ambao walikuwa wamefungwa kwa miaka mingi). Uchunguzi wa kiuchunguzi pia hutumiwa kuanzisha ubaba na kutambua mabaki ya wanadamu kutoka kwa matukio ya maafa.

[Sifa na marejeo]

Je, wewe ni mwanafunzi au mwalimu?

Mwalimu Mwalimu

 


Wakati wa kutuma: Jan-08-2021